當今時代，保持領先地位很重要，次世代定序(NGS)為創新定序平台，可行執行將近數百萬個定序反應，並同時分析其定序數據。最近，醫療保險和醫療補助服務中心(Centers for Medicare & Medicaid Services, CMS)發佈使用NGS診斷晚期癌症患者的診斷測試，這一決定無疑將加速NGS在臨床診斷中的使用。
早在1982年科學家開始進行DNA定序實驗前，實驗室資訊管理系統(LIMS)已投入商業使用，幫助控制實驗室處理程序，追蹤樣品以及實驗室工作流程和數據。透過LIMS協助DNA次世代定序，以及現代實驗室測試，可提供更高品質的診斷測試和更有效的程序，並有助於簡化DNA定序過程。
40年前，DNA定序是一項費工費力的手動過程，使用放射性物質檢測，僅生成分離的DNA分子序列。以一小段已知道DNA鹼基對序列，作為引子(primer)，用於定序酶的初始結合位點，從而產生以前未知的序列。新序列的末端將用作下一輪定序的引子。使用這種稱為Sanger定序的方法，整個基因可以一次定序數百個鹼基對。平均基因長度為10至15,000個鹼基對(base pairs)，整個實驗卻耗時耗工。
NGS為第一個以Sanger基因定序法(amplicon sequence)為目標的次世代定序平台，並於本世紀初出現，其能並行數百至數百萬次定序反應以及分析產生的定序數據。與早期的DNA定序應用相比，如今的NGS平台不僅能生成大量數據，且速度更快也相對便宜。成本不斷下降，從而促進了NGS的使用，此一自動DNA定序的形式，為現今提供了很多新應用。如今，NGS已進入醫療保健領域，並用於臨床診斷測試，包括整個外外顯子定序(exome Sequence)、DNA標靶定序(DNA target-based sequence)、RNA定序和染色質免疫沉澱定序(chromatin immunoprecipitation sequence)等的以患者個體為中心的創新研究發展。
NGS引領臨床診斷測試領域
在臨床診斷領域，NGS被用於遺傳病診斷、腫瘤學、遺傳諮詢和傳染病管理等領域。FDA批准了最初的NGS測試是針對遺傳性疾病的，特別是Illumina的MiSeqDx囊性纖維化(Cystic Fibrosis)139-Variant檢測法和MiSeqDx囊性纖維化臨床定序法。在臨床腫瘤學領域，NGS用於疾病的癒後並有助制定治療決策。NGS也在支援個人化醫學方法的開發，與已開發並批准僅用於具有特定遺傳定義的腫瘤的患者亞組的藥物配對使用。因此，這種技術也可能有助於更好地定義基因調控。
第一個獲得FDA批准的NGS伴同式診斷(Companion Diagnostic, CDx)是Foundation Focus CDxBRCA，它有助於確定正在考慮使用Clovis腫瘤學的Rubraca (Rucaparib)治療的BRCA突變的卵巢腫瘤患者。接下來批准的兩個NGS伴同式診斷方法是用於鑑定有資格接受Vectibix治療的大腸癌患者的Illumina的Praxis Extended RAS Panel，和用於選擇具有特定基因的非小細胞肺癌NSCLC患者的Thermo Fisher Scientific的Oncomine Dx Target Test。
FDA批准的測試遵循特定的、經過開發和驗證的程序，但即使是最簡單的FDA批准的NGS測定方案，也涉及多個步驟和程序的複雜工作流程。基本的NGS工作流程可能遵循多個實驗室的路徑，並在不同實驗室之間執行，包括樣品製備、DNA樣本庫製備和DNA片段定序。在上游接收並記錄各個工作流程樣本資訊，並且必須在發佈結果之前對產生的數據進行下游分析，使用LIMS系統管理這些工作流程可以大大提高實驗室的效率和熟練度。
對於正在執行NGS測試和分析開發的實驗室，設置和調整復雜的工作流程可能既耗時又復雜，因此遵循更標準程序的預設置的工作流程是有利的。當實驗室針對DNA定序的臨床應用進行NGS測試時，會牽涉更多的複雜性。在許多情況下，FDA批准的測試都帶有確定的性能特徵、標準和管控標準，以證明結果的有效性。已被FDA批准的某些測試，例如Illumina的MiSeqDx囊性纖維化139-Variant分析，仍然需要結合其他實驗室和臨床資訊來查看和解釋結果。隨著用於臨床目的的NGS測定指數化的開發和發佈，也已制定了與NGS測試和結果報告相關的特定程序指南。
監管機構努力趕上NGS
在美國，臨床實驗室受到多個理事機構的監督。醫療保險和醫療補助服務中心以臨床實驗室改進修正案(CLIA)規範實驗室測試，而可能產生比CLIA設置的要求更為嚴格的規範。實驗室專業組織，例如美國病理學家學院(CAP)，也為臨床實驗室制定了最佳實踐指南。隨著分子技術的發展，美國醫學遺傳學和基因學院(ACMG)和分子病理學協會(AMP)等組織也加入了這一領域。
2015年，ACMG和AMP發佈了關於基因檢測用於臨床診斷的聯合指南1。這些準則強烈建議在CLIA認證的實驗室中進行臨床分子遺傳測試，並包括誰可以解釋結果的細節1。這些指南還指出，有必要進行結果確認，如指南所述，尤其是序列變異1。出版物也參考了ACMG(2013)先前專門針對NGS發佈的指南所推薦的驗證性測試方法，並為開發、測試和驗證方法論以及報告標準提供了指導2。
與ACMG同時，2014年CAP在CAP分子病理檢查清單中增加了18個新的實驗室認可檢查清單要求。這些要求適用於跨多個疾病領域的NGS的測定，包括遺傳性疾病、分子腫瘤學和傳染病3。這些要求分為web-lab和dry-lab(電腦演算)，涉及NGS的許多主題，包括確認性診斷測試3。
有LIMS系統開始適應複雜的NGS工作流程，其中涉及多重樣品處理和實驗室內的多種學科，但不一定將它們配置為一條龍的管理工作流。為了獲得最終結果，NGS在很大程度上依賴於數據分析，分析取決於DNA定序軟體的初步評估。初步分析需要確定核苷酸鏈各個拷貝的確切序列，將短讀段與重疊的較長讀段進行比對，然後比較各個讀段以識別變異體，同時考慮信號強度、錯誤和其他品質指標。臨床NGS實驗室希望為已鑑定出的變異體以及這些變異體在臨床上是重要還是良性的設定判斷值2，人們還期望保持高品質的標準，以用於實驗室開發的診斷測試，尤其是保證低的假陽性率。
根據ACMG次世代定序的臨床實驗室標準，“建議所有針對疾病和診斷的測試均應使用配套技術對最終結果進行確認。”2期望隨著技術的進步，只有使用經驗豐富且經過演算法驗證的大多數經驗豐富的NGS實驗室都在考慮消除使用正交技術進行的確認測試(confirmatory test)，每種類型變體所需的廣泛驗證，轉向Sanger定序作為確認變異的DNA測試。
Sanger定序特別有用，因為“目前建議所有針對疾病的高產量基因檢測均應覆蓋每位接受檢測的患者的所有檢測”2，這在基因檢測和其他複雜標靶的檢測中都可以找到。同時，可以使用通常在腫瘤組織分析或鑲嵌變體中常見的重複測試，或使用諸如螢光原位雜交(FISH)等伴隨技術來驗證測定。
LIMS符合NGS工作流程
許多實施了LIMS來管理其NGS工作流程的實驗室都這樣做了，包括記錄變異呼叫結果。無論是使用一個LIMS還是組合多個系統，最終目的皆是使用資訊技術來管理整個NGS過程。從樣品提取、DNA樣本庫創立和擴增的自動DNA定序，實驗室現在也開始將數據分析鏈接到其工作流程。但是，確認性測試通常不包括在工作流中。更確切地說，驗證性測試通常視為單獨的測定法和甚至可能不被包括在LIMS的管理驗證測試的完整工作流上游處理範圍內。然而，ACMG建議應在需求之前計劃確認測試(confirmatory test)2，而CAP則指出實驗室必須制定執行所需確認測試(confirmatory test)的政策。3
此外，提供預計試驗周轉時間時，實驗室應考慮執行行確認測試(confirmatory test)所需之時間。而在初步結果之前，驗證測試完成釋放的情況下，建議的報告狀態驗證測試尚未進行。例如，“以下結果尚未通過替代方法或重複測試得到證實。”1
範例
遵循CAP/ACMG指南，由20個基因組成的試驗盤將需要檢測出的突變和新的變異體，這些突異和新變異體必須以Sanger定序來確認其品質要求。在這種假設情況下，假設具有檢測到的突變和新的變異調用的患者的比例為10％，在試驗盤中的20個基因中，驗證性測試分為5種可能的方案。因此，每天要運行數百個患者樣品的大量實驗室可能需要這些樣品中的10％進行某種確認性測試。譬如，500的患者樣品50將需要被執行的20個可能確定測試。
利用LIMS滿足NGS中的法規要求
為了在LIMS中容納確認性測試，可以根據返回的結果為下一個測試或反射測試設置規則。理想情況下，這將是無縫工作流程的一部分，該工作流程無需將新樣品重新提交到實驗室，也無需人工監督方法的分配。相反，它會遵循既定規則，將測試自動重定向到確認方法，並在最終報告發佈之前等待確認結果。
使用多基因癌症專家小組評估患者樣本的大量實驗室面臨著特別具有挑戰性的工作流程。Sanger定序(Amplicon定序)是用於驗證性測試的最常用方法，它允許在同一平台上使用不同的DNA複製引物對(Primer Pairs)，但是不太可能對與NGS基因組相關的所有可能的引物一起進行評估。如果已經存在將樣品定向到不同測試的規則，並且識別出可以同時執行的測試，而不必手動添加測試和步驟，那麼使用LIMS管理需要確認測試(confirmatory test)的樣品數量將容易得多，可以在驗證後將它們鏈接到原始樣本。
NGS可開發先進的臨床測試，這些測試可提供更有針對性、更有效的患者護理。但是，臨床環境中對NGS的測定和結果分析的複雜性意味著可能需要進行確認性測試。對於臨床和非臨床測試實驗室而言，將驗證性測試納入其LIMS流程應是自然發展的過程。可以在開發新測試時配置工作流程，並添加其他驗證方法。
利用LIMS結合預定義邏輯的實驗室樣本測試方法學，可以幫助提高實驗室效率。隨著NGS方法在過程和數據複雜性方面的發展，在臨床和研究環境以及DNA定序的其他應用中，LIMS自動化和管理工作流程、過程以及結果分析和報告的能力將變得更加無價。
好處是多方面的。符合規則的確認測試(confirmatory test)方法自動選擇、樣品計劃和結果報告，可以節省大量成本和時間，同時減少人工輸入數據潛在錯誤的可能性。LIMS自動化還降低對單一樣品進行確認性測試的可能性。使用單一平台來管理所有樣品並協調第一輪和確認性測試以及結果報告，可提供更完整的流程和數據儲存庫，可單點登訪進行存取且將機密報告更快地提供給醫生和臨床人員。
參考
Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015; 17: 405-424.
Rehm HL, Bale SJ, Bayrak-Toydemir P, et al. ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing. Genet Med. 2013; 15: 733-747.
Aziz N, Zhao Q, Bry L, et al. College of American Pathologists’ Laboratory Standards for Next-Generation Sequencing Clinical Tests. Arch Path Lab Med. 2015; 139: 481493.